实验指导

目     录

实验一  分子生物学实验室常用仪器及使用方法

实验二  质粒DNA的提取－碱裂解法

实验三   琼脂糖凝胶电泳

实验四   限制性内切核酸酶的酶切与鉴定

实验五   大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

实验六   动物组织细胞基因组 DNA提取

实验七   DNA的定量

实验八  PCR基因扩增

实验九   琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA

实验十   DNA重组

实验十一 动物组织细胞总RNA的提取

实验一   分子生物学实验室常用仪器及使用

        事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。

        一、冷冻离心机

           低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。

       1.  安装与调试

       离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。

2.  操作程序

   （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。

          （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。

          （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。

          （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升 至预先设定的值。

    （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。

    （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。

              3.  注意事项

    （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。

          （2）开机前应检查转头安装是否牢固，机腔中有无异物掉入。

          （3）样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。

          （4）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。

   （5）除工作温度、运转速度和运转时间外，不要随意更改机器的工作参数，以免影响机器性能。转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。

   （6）使用中如出现0.00或其它数字，机器不运转，应关机断电，10秒钟后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。

          （7）不得在机器运转过程中或转子未停稳的情况下打开盖门，以免发生事故。

          （8）每次操作完毕应做好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。

二、电泳仪

        电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳大类，自由界面电泳不需支持物，如等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。区带电泳需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶―G薄层等，分子生物学实验中最常用的是琼脂糖凝胶电泳。应用电泳法可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组份分析或单个组份提取制备。下面以DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）为例介绍其使用方法。

1.使用方法

（1）按电源开关，显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，见图一：

 U:      0V     U＝   100V   ｜   Mode：  STD

I:      0mA    I ＝   50mA   ｜  

P:      0W     P＝    50W   ｜

T:    00:00     T＝   01:00   ｜   

         其中:左侧大写U: I: P: T: 为电泳时实际值；中间部分显示程序的常设值（预置值）。Mode(模式)：STD(标准)；TIME(定时)；VH（伏时）；STEP（分步）

   （2）设置工作程序。用键盘输入新的工作程序。例如，要求工作电压U＝1000V，电流I限制在200mA以内，功率W限制在100W以内，时间T为3小时20分，并且到时间自动关掉输出。则操作步骤如下：

①按“模式”键，将工作模式由标准（STD）转为定时（TIME）

模式。每按一下模式键，其工作方式按下列顺序改变：           STD®TIME®VH®STEP®STD。

       ②先设置电压U，按“选择”键，先将其反显，然后输入数字键即可设置该参数的数值。按数字1000,则电压即设置完成。

      ③设置电流I，按“选择”键，先使I反显，然后输入数字200。

      ④设置功率P，按“选择”键，先使P反显，然后输入数字100。

      ⑤设置时间T，按“选择”键，先使T反显，然后输入数字320。如果输入错误，可以按“清除”键，再重新输入。

       ⑥确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）。

       ⑦每次启动输出时，仪器自动将此时的设置数值存入“MO”号存储单元。以后需要调用时可以按“读取”键，再按“0”键，按“确定”键，即可将上次设置的工作程序取出执行。

       ⑧电泳结束，仪器显示：“END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣。

2.注意事项

(1)U、I、P三个参数的有效输入范围是：U：5～3000V；I： 4～400mA；P：4～400W.

(2)一般情况下，当No  Load！时，首先应关机检查电极导线与电泳槽之间是否有接触不良的地方，可以用万用表的欧姆档逐段测量。

(3)如果输出端接多个电泳槽，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和，此时应选择稳压输出，以减小各槽的相互影响。

(4)注意保持仪器的清洁，不要遮挡仪器后方进风通道。严禁将电泳槽放在仪器顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。

(5)本仪器输出电压较高，使用中应不避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。

(6）长期不用仪器，应放置在干燥通风的清洁环境中保存。

        三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方法，是获得可靠分析结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天平、半自动/全自动电光分析天平及电子分析天平等。目前实验室常规备用的是自动化程度较高的电子分析天平。下面介绍电子分析天平 PL203/01型和AL104/01型 (METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密电子天平：最大称量210g；实际分度值0.001g；AL104/01型高分辨率电子分析天平：最大称量110g；实际分度值0.0001g

        1.  使用方法

     （1）检查并调整天平至水平位置。检查电源电压是否匹配（使用配置的稳压器），按天平仪器要求通电预热至所需时间30min 。

     （2）打开天平开关“on”，天平则自动进行灵敏度及零点调节。待显示屏上所有字段短时点亮，天平回零时，可进行正式称量。

    （3）称量时将洁净称量瓶或称量纸置于称盘上，关上侧门，天平将显示该重量，点击“®O/T¬”键自动校对零，然后逐渐加入待称物质，直至所需重量为止。

    （4）称量结束应及时除去称量瓶（纸），关上侧门，切断电源，并做好使用情况登记。

       2.  注意事项

    （1）天平应放置在牢固平稳水泥台或木台上，室内要求清洁、干燥，同时应避免光线直接照射到天平上。

    （2）称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动。

    （3）挥发性、腐蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，防止腐蚀天平。

    （4）电子分析天平若长时间不使用，则应定时通电预热，每周一次，每次预热2h，以确保仪器始终处于良好使用状态。

         四、分光光度计

不同物质对不同波长入射的吸收程度各不相同，从而形成各具特征的吸收光谱 。根据这一原理，应用比色法可以对某些有色物质进行定性或定量分析。但由于比色法仅限于可见光区，而且精度低，已远远不能满足高精度微量分析的要求。随着科学技术不断发展，分析仪器也不断地更新换代，人们引进了分光光度法的概念，分光光度计随之应用。分光光度计由光源、单色器、吸收池、接受器、显示屏幕所组成，它不仅适应于可见光区，同时还扩展至紫外光区及红外光区。光密度（OD）是许多溶液中的溶质定量的指标之一，通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值。分子生物学实验中常使用紫外分光光度计进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。下面介绍紫外可见光分光光度计GeneQantTM Pro（Amersham）的使用方法。该仪器除了能检测核酸样品浓度外，还可进行蛋白质浓度以及细胞培养液浓度的测定，能检测低至几微升样品（70µl和5～7µl），样品无需稀释，测量后还可全部回收。

使用方法

(1）打开电源开关（ON），等待数秒钟，显示屏上显示一系列数据，如本机型号、当前日期等，这些数据可以重新设置，当出现“instrument  Ready”即可进入下一程序。

 (2）在仪器面板上有许多功能键，其中包括检测base sep 、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲检测DNA， 按DNA键，即进入DNA检测程序。在显示屏上：                      

                                          Pathlengh              10mm

                                          Units                      µg/µl

                                         Use 320nm              NO

                                        Dilution Faotor  1

                                        Insert  reference,    

以上为仪器预设置的参考数据，若按“enter”键，和“select”键可以将以上的参数进行重新设定。

(3）取石英样品杯70µl或5～7µl ，容量大小根据需要。先用吸管吸高纯水入样品杯中，然后放入仪器上的样品槽中，放入时注意样品杯的光学面朝前方。

(4)按“set  ref”键，进行空白测试。显示屏上出现一系列数据均“0.000”并提示插入样品“Insert sample ”。将样品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同样吸入待测样品，放入样品槽中进行测定。

(5）一个样品测定完毕，按“stop”键，返回“Instrument Ready”。

(6）取出样品杯，吸出样品，然后用高纯水洗几次，自然晾干。由于样品杯十分昂贵，使用时要小心操作。不能用手指拿样品杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。

  五、数字式酸度计

       酸度计是实验室配置溶液必备的仪器。本实验室的酸度计为台式微电脑酸碱度计和温度计（Hanna）,测量pH范围为0.00～14.00pH；温度为0.0～100.0℃；

       1.  使用方法

   （1）将pH电极和温度探头与主机连接，主机与电源连接。

   （2）取出电极保护套，如果有结晶盐出现，这是电极常见现象，浸入水后就会消逝。如果薄膜玻璃或透析膜发干，可在HI170300电极保存液中浸泡1小时。

（3）pH校准。将pH电极和温度探棒浸泡在所选的标准缓冲液内4cm（建议用pH6.86、7.01），缓冲液值可通过“D℃”或“Ñ℃”键来调节。按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“7.01”数据。当读数不稳定时，屏幕会显示“NOTREADY”；当读数稳定时，屏幕会显示“READY”和“CFM”，按“CFM”键确认校准值。确认第一校准点后，将pH电极与温度探棒浸泡在标准缓冲液内4cm（建议用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“4.01”数据。按“CFM”键确认校正值。

 （4）pH测量。校准完毕后，仪器自动进入pH测量状态，将电极与温度探棒浸泡在待测溶液约4cm，停几分钟让电极读数稳定。

2.  注意事项

 （1）由于pH211酸度计内装有可充电电池，在刚购买或长时间放置后，再使用时，通电校正测量完毕后，可将电源继续还插入电源插座，只需关闭开关，这样可以保证电池充电，是校正值得以储存，下次测量时无须校正即可进入精确测量。

 （2）不可用蒸馏水、去离子水和纯水浸泡电极。如果读数偏差太大（±1pH），则是由于没有校正或电极变干。为避免电极受损，在关机前要将pH电极从溶液中拿出。当处于关机状态时，在电极浸入电极保存液前，电极要与机器分开。

 （3）如仪器已测过几种不同的样品溶液，请用自来水清洗，或在插入样品溶液前，用待测样品清洗电极。

 （4）温度会影响pH的读数，为测量准确的pH值，温度要在适合的范围内进行自动温度补偿，用HI7669/2W温度探棒浸入样品中，紧靠电极并停几分钟，如果被测溶液的温度已知或测量是在相同温度下进行，只需动手补偿，那么此时温度探棒是不用连接，屏幕上会显示温度读数伴有℃信号闪烁。温度可通过“Ñ℃”或“D℃”来调节。

六、PCR仪

PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行DNA变性、引物复性、DNA聚合酶催化的延伸反应的三个过程。

PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域，如基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学等等。随着分子生物学的不断发展，PCR扩增技术也得到普及推广应用，因此了解PCR仪的性能，熟练掌握仪器的正确使用方法及使用过程中的注意事项，将是十分必要的。

现介绍PCR 扩增仪（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事项。

1.  使用方法

(1）接通电源开关，仪器进入准备状态；在显示屏上记录了当前仪器的温度和盖子（Lid）的温度。若仪器正在运行时，须按“  B  ”键（start/stop），才能退出运行并返回准备状态。

(2）编写程序段。在准备状态下按“  C ”键(programs)进入编程状态，选定一程序号，然后按“enter”键，进入下一程序；按 “A”(list)键后，选一文件号（empty program）；再按“enter”键，进入下一程序；按“ABC”键，进入下一程序，用上下左右键号选择一个字母（A、B、C、D、…），然后按“enter”键，进入下一程序；按“name ok”键，完成文件命名。

(3）设定盖子的温度。“lid temp：    ℃”，盖子的温度一般比变性温度要高10℃，例如变性温度是95℃，那么盖子的温度就要设定为105℃。待盖子预热后按“enter”键，进入下一程序。

(4）设定变性温度、变性时间、延伸温度、延伸时间、退火温度、退火时间及循环总数等参数。从第一步依次按“enter”键进入，用四个移位键移动设定位置。先设定温度，后设定时间，全部参数设置完后，按“pgm ok”键，所设定的程序自动被保存。

(5）运行程序。检查设定是否正确，  按“start”键，选择设定好的程序，开始运行。显示屏上可观察到系统运行的情况，按“Stop”可停止运行。

七、凝胶成像系统

本系统属全自动电脑控制影像分析系统，主要拍摄核酸的agarose电泳胶片，及蛋白质的acrylamide电泳胶片。在与markers比较后，可精确计算样本的分子量，对核酸电泳也可准确定量，是分子生物学及生化蛋白试验的重要检测工具。本系统包括暗箱，紫外透射仪，摄像头，变焦镜，电脑以及专业凝胶图象采集及分析.软件（3.3版）。该软件提供对电泳凝胶、斑点测量、PCR密度的定量分析等。此外，还提供图像采集、标注、打印、数据和图像发送到Word、Excel、图像处理等功能。

1.使用方法

       (1) 打开电脑，启动凝胶分析软件，进入用户界面。

    （2）打开采集凝胶图像的暗箱装置电源开关，放入凝胶，打开紫外光源或白光光源，将采集装置与电脑上采集卡相连，然后选择“文件”菜单中的“图像采集”或工具栏的“图像采集”按钮，出现图像窗口：“开始采集”、“停止采集”、“采集图像”等。如果图像不清晰，可以调节暗箱上的变焦镜，使之清晰。可直接将图像保存起来，也可通过“图像处理”对图像进行旋转、裁剪、滤波、调节对比度……方面的处理。

       (3)对读入的电泳凝胶图像，可以启动电泳凝胶分析系统。在“功能选择”菜单中选择“电泳凝胶”或在工具栏上的“电泳凝胶”工具，将出现泳道分析工具栏，并在“图像显示”子窗口中出现一个红色的矩形框。还可进入“条带分析”系统，对条带 进行编号，对二条以上的条带进行比较。

     （4）采集图像结束后，关闭暗箱电源开关，从暗箱中取出凝胶，并将玻璃板清洗干净，晾干。

八、空气恒温摇床

摇床（振荡器）为实验室的常规设备。SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床，采用微电脑控制系统，温度范围：室温＋5℃～60℃，精度±0.5℃；时间范围：1分钟～99小时59分钟；转速范围：60RPM～250RPM。

1.使用方法

(1）LED屏幕上各段数据：

                                 RPM       Temp       Time

       1    000           00.0       00:00

屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段则为“2”，“Temp”表示温度，“RPM”表示每分钟转速，“Time”表示时间，不设定时可自动累计时间一直运行。“Temp”、“RPM”、“Time”的值随时可以修改，随时按新值运行。

(2）工作程序设置。按“F1”键，进入设置状态。可在速度，温度，时间，运行等四部分之间切换。在每一部分按“F2”键输入数据，输入完十位数据，再输入个位数据，按“F2”键，再按“F2”键，到小数位，再按“F2”键，又到十位，以此循环。

(3）再按“F1”键，转回运行状态，按“Start”键，电机开始运行，时间开始计时。

(4）按“End”键，结束系统运行。

        2.  注意事项

     （1）打开电源，系统开始自检，等待LCD屏幕出现“WELCOME”字样，系统自检完毕，可以进行第2步参数设置。若屏幕出现：a.“TEMP ERROR”，表示温度检测线路有错误；b.“MOTOR ERROR”，表示电机部分有错误。

     （2）运行过程可以打开箱盖，这样电机不运行，时间也停止，盖上盖接着运行。

     （3）工作完毕，关闭电源。关机后，要等一段时间再开机。

        九、水的净化装置

分子生物学实验对水的纯度要求越来越高，一般蒸馏水常常难以满足实验要求，大多要求要进行第二次蒸馏（双蒸水），它可以去除水中的大部分有机杂质，但制作时间较长，而且无机杂质还是很多。许多实验还需要去离子水，这就需要阴阳离子交换树脂进行处理。目前，分子生物学实验室都使用高质量的超纯水。如美国微孔滤膜公司的Milli-Q超纯水制造系统所制造的超纯水适用于许多学科领域，如分子克隆、各种色谱分析、氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等实验。下面介绍RO-MB壁挂式反渗透高纯水机性能及使用方法。RO-MB反渗透高纯水机（杭州永洁达）产水量（25℃）10L/H；产水水质：RO纯水：<10μs/cm，高纯水：>15MΩ.cm；可用自来水制成普通实验用水和高纯水，同时满足不同水质要求。在线电导率仪对产水水质连续检测，可保证产水质量。

1.  使用方法

(1)准备：先检测与纯水机相连的原水管路、废水管路连接是否正常，打开原水阀门。供电电源是否正常，检查按钮是否在关闭状态（按钮弹出状态）。将电源插头插入带有接地线的220V电源插座上。

(2）开机：依次按下电源开关，泵开关，纯水机启动产水，同时废水排出，指示灯亮起，并处于自动运行状态。

(3）取纯水：若打开RO纯水或高纯水出口阀门，则可获得相应水质的纯水。当高纯水出口阀门打开时，检测仪表显示高纯水电导率或电阻值。为了获得高质量的高纯水，可以先放掉一杯水后再取新鲜水。

(4）关机：不用时可关闭个按钮停机，自来水进水阀门不必关闭，这时机子内部的进水电磁阀已自动切断水路。只要管路阀门不漏，也可使机子保持自动待机状态。

2.注意事项

  （1）纯水机的正常使用环境温度为15～35℃，产水量会随温度降低而下降，冬季保养温度不低于5℃。

  （2）预处理滤芯一般三至六个月更换一次，实际使用寿命与自来水水质、总过滤量等有关。

  （3）混床滤芯产高纯水约1～3吨，约二至四个月更换一次，实际使用寿命与自来水水质、水中含盐量、总用水量等有关。设备停运时间超过2天。必须注意定期冲洗维护。夏季宜每天开机30分钟冲洗一次，冬季每隔2～3天开机冲洗一次。

  （4）使用过程若发现停机后泵仍频繁地每隔数分钟有规则地启动数秒钟又停机，此为管路漏水引起，需及时打开机箱加以解决。若每隔半小时以上启动数秒钟又停机，乃属正常现象，有利于冲洗和保护反渗透膜元件，避免遭到微生物繁殖和减少污物沉积，尤其高温季节。

十、消毒设备

细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的试剂、器皿及实验用具，应严格灭菌，有的实验还要求没有核酸酶的污染，故应将实验器械，试剂等进行高压消毒。对于经过导入DNA重组分子的菌株，操作后必须进行严格的高压消毒灭活处理。

大批实验物品、试剂、培养基等可以使用大型消毒器进行消毒。一些不能经受高压、高温消毒的试剂可用滤器滤膜除菌，器皿可用紫外线照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）浸泡消毒。所有的细胞培养、细菌培养的操作，都应在紫外线消毒后的超净工作台中进行。

下面介绍立式自动压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI）的使用方法。

1.使用方法

  （1）开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈。

  （2）通电：连接自动进水装置。接通电源，将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低（LOW）红灯亮，蒸发锅内属断水状态；缺水（LACK）黄灯亮，电源已正常输入。

  （3）加水：打开水源，水位达到低水位，控制面板上低水位红灯和缺水黄灯相继灭，加热（1-绿灯）亮，继续加水至高水位（HIGH）绿灯亮，自动停止加水。

    （4）堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。

    （5）密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧。

    （6）设定温度：通电后数显窗灯亮，上层为红色，显示温度，下层为绿色，设定温度和时间。先按控制面板上确认键，绿色数显闪烁，进入温度设定状态。按一次移位键   所指相应位置闪烁，根据所需数据位置进行（单项循环）移位。按△增加键或??减少键，进行所需温度设定。设定完毕，按二次确认键，进行温度确认。

    （7）设定时间：按一次确认键，将温度设定切换成时间设定；再按一次移位键，所指相应位置闪烁，根据所需数据位置进行移位；按增加键或减少键，进行所需时间设定。设定完毕，按二次确认键，进行时间设定确认。时间采用倒计时，当灭菌锅内温度达到设定温度，定时器开始倒计时。

    （8）灭菌：在加热初，将下排汽阀打开至垂直位置；下排汽阀待蒸汽冒出时，压力表显示指示为100℃时，将下排汽阀推向水平关闭位置；留有微量蒸汽逸出，以控制总汽流量的15%为宜。使用最高灭菌温度为124℃～126℃，压力在0.145Mpa～0.165Mpa范围内属于安全阀设定数，超出压力部分，安全阀将自动泄压，并开始计数灭菌所需时间。灭菌完成，电控装置将自动关闭加热系统，伴有蜂鸣提醒；并将保温时间切换成END显示；此时，将控制面板上电源开关按至OFF处；关闭电源，停止加热待其冷却。

  （9）干燥：物品灭菌后需要迅速干燥，须打开放汽阀和下排汽阀，将灭菌器内的蒸汽迅速排出，使物品上残留水蒸汽快速挥发。

  （10）将盖开启，取出已灭菌物品。关闭水源，打开下排水阀，排尽灭菌室的水与水垢，以备下次使用。

2.注意事项

  （1）堆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出汽孔，必须留出空位保证其空气畅通，否则安全阀因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。

  （2）灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞，特别注意，在灭菌液体结束时不准立即释放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可排放余汽。

  （3）对不同类型，不同灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免顾此失彼，造成损失。

实验二    质粒DNA的提取－碱裂解法

     一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

二、仪器及试剂

    1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

    2.试剂及配制：

    LB培养液的配制：

    酵母浸提物    5.0 g；

    胰蛋白胨      10.0 g；

    NaCl             10.0 g；

依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml，10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃保存。

      溶液 Ⅰ（GET缓冲液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

     配制：1000 ml

                                   1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）         25 ml

                                   0.5 mol/L EDTA（pH8.0）          20 ml

                                   20% Glucose（1.11mol/L）         45 ml

                                                dH2O                                 910ml

将以上溶液混合装瓶， 10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃保存。

溶液II（变性液）：200 mmol/L NaOH  ， 1% SDS

配制： 500 ml          

                         10% SDS               50 ml

                          2N NaOH             50 ml

取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存，此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。

注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 

溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸

配制：500 ml

醋酸钾                     147 g

冰醋酸                     57.5 ml

加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压灭菌后，4℃保存。

10×TE缓冲液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制：1000ml

1 mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0)         100ml

500 mmol/L EDTA (pH8.0)                   20 ml

加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后，4℃保存。

苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它试剂：TE（pH8.0）、异丙醇、氯仿/异戊醇（24:1）、无水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素贮存液（50 mg/ml）

三、操作步骤

1.菌体的培养和收获

(1）将5～10 ml含有氨卞青霉素（AP）的LB培养基加入到容量为100ml的三角瓶中，然后接入一单菌落，并保持通气良好，于37℃ 220 rpm振摇过夜培养（约16h）后可以再转接一次，于37℃ 220 rpm振摇培养3～4 h。

(2）吸取培养的菌液1.5 ml，转入1.5 ml的离心管中，用台式离心机以12000 rpm离心3 min。弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

2.质粒DNA提取（碱裂解法）

（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重悬细菌沉淀，用枪吹打直至混和均匀。

（2）加200 ul溶液 Ⅱ，盖紧管口，轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。室温静置5 min（溶液变透明，粘稠）。

（3）加150 ul溶液 Ⅲ，轻微振荡混和10 sec，置冰上10 min (溶液出现白色沉淀)。

（4）12000 rpm离心6 min，取上清液至另一离心管（弃沉淀）。

（5）加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀1 min，12000 r/min离心6min，取上清液至另一离心管。

（6）加1倍异丙醇，振荡混匀，静置10 min，12000 rpm离心6 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。

（7）加200 ul 70％乙醇洗涤沉淀物，台式离心机12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。

（8）沉淀加20μl TE,  反复吹打使质粒DNA充分溶解，－20℃保存。

四、常见问题及可能原因

1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。

2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。

3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓度或pH）。

实验三    琼脂糖凝胶电泳

一、实验原理 

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium  bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。                                                                                                                                                                                                                                      

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：

水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：

50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）

配制1000 ml

Tris                   242 g

冰乙酸                57.1 ml

0.5 mol/L EDTA        100 ml

加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：

称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。

溴化乙啶贮存液：10 mg/ml  溴化乙啶

配制：100 ml

称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。

6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10 ml

            溴酚蓝              25 mg

            二甲苯青FF    25 mg

             甘油                   3 ml

用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。

其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、

三、操作步骤

1. 制备1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3. 加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。

4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60－100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

(5）电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。

(6)观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

四、常见问题及注意事项

1．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。

2．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。

3．电泳时应注意电源线路，预防触电。

4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。

5．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。

6．DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。

7．质粒DNA的存在形式有3种，①共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；③线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA > 线状DNA > ocDNA。

实验四    限制性内切核酸酶的酶切与鉴定

    一、实验原理

         限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。        

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

                                 5′……GAATTC……3′

                                3′……CTT AAG…… 5′

 EcoR I以独特的方式识别并裂解这个顺序，形成两个5′突出末端：

和

            ……G                              AATTC……

                          ……CTT AA                            G……

这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。  在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

     二、仪器与试剂

1.仪器：

        水浴锅、离心管、移液器、吸头、 电泳设备等。

        2.试剂：

质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

    三、操作步骤

1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。

2. 酶切反应体系（10ul）：

酶解缓冲液（10×buffer）    1 ul

  限制性内切酶                          0.5 ul EcoR I(7.5U)    

底物DNA（质粒）                 x ul（依质粒浓度而定）

灭菌ddH2O                              加至10 ul

           限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。37℃水浴消化2h。

        3.酶切完毕，取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切反应效果，必须用DNA分子量标准物同时进行电泳以确定DNA片段的大小。如果酶切不完全，可继续.酶解消化反应，或加入适量酶后继续反应。

5. 经电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反应，将剩余酶切产物保存于?C20℃备用。

    四、注意事项

    1.限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。

       2. 限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分摇匀。

      3. 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

      4. 酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深。

       5. 酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。

        6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积的10%，以避免酶液中甘油干扰反应  。酶量过大（≥25U/ug DNA）时，有产生所谓星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少NACL和存在M等情况下，都有可能出现星号活性。

           五、相关问题

    1.酶的保存

         不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：

            Tris-HCl  （7.4―7.8）：          维持稳定的pH范围。

           50-100mmol/L   NaCl或KCl：提供一定的离子强度。

           0.1mmol/L  EDTA：                   络合掉能激活限制酶的镁离子。

            1mmol/L   DTT：                        保护酶分子上的还原性基团。

           200-500ug/ml BSA：                   牛血清白蛋白提高溶液中蛋白质的浓度，防止蛋白质分子浓度过低而导致酶分子变性。

            50%的甘油：                             使酶液保存于-20℃不至冻结。

        1-5 g/L的Triton-100：                这是一种非离子型表面活性剂，能防止蛋白质分子的表面变性作用。

         2. 酶单位的定义

         限制酶的单位通常定义为：1U的酶能在约50ul合适的反应缓冲体系中，在1h内完成酶切1ug的λDNA。确定限制酶单位的具体操作方法是分别向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），当电泳观察到酶切片段的条带不再发生变化时说明已作用完全，完全切割的最少酶量定为1U的酶量。

        3. 限制酶的作用条件

         限制酶切割DNA的反应中，酶切条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系，除了这些条件外，DNA的纯度与浓度也会影响酶切效果，只有在正确选择酶反应条件时才能达到**酶切效果。

       （1）作用温度

         早期的酶切反应都在37℃进行，这种方法虽然简单、统一，但却不能达到每个酶的最适反应温度。为了达到**酶切的*****根据所选用的酶确定所需要的反应温度。

       （2）缓冲体系

          限制酶反应的缓冲体系大致相同，都含有以下组分：约100mmol/L的Tris-HCl，作用是将酶反应体系的pH维持在7.5-8.5；约10mmol/L的MgCl2，作用是为限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保护还原性基团；约150mmol/L的NaCl，作用是提供合适的离子强度。由于认识的局限性，早期的限制酶反应体系仅根据其中NaCl含量的不同分为高盐、中盐与低盐三种，这同样不能使每种酶获得最适反应条件。现在提供酶的很多厂商能提供4-10种缓冲体系，其中各必需成分之间只有很小的差别，目的是使每种酶都发挥最大的作用。

缓冲液一般配成10倍的浓度，使用时以1/10的比例加入，当然为了减小吸量误差也可自行配制5倍的缓冲液。

        (3) 反应体积与时间

         酶反应体积一般不宜小于20ul。因为过小的反应体积在加入各种成分时易产生误差，甘油含量易超过10%。在37℃保温可因水分蒸发而明显改变反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活力。同时还要考虑反应完毕进行电泳时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显出清晰的泳带。

         常规的酶切反应一般控制在60min内进行，但也可以根据切割对象与所用的酶将保温时间延长至十几个小时。

        (4) DNA的纯度与浓度

         除了上述酶反应条件外，影响酶切效果的最主要因素是DNA的纯度。例如，样品中含有大量RNA杂质时会因减少了酶的有效浓度而影响酶切效果；某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。。至于抽提过程中未除净的各种影响因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等。

         DNA纯度的另一个指标是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后电泳结果显示出不清晰条带或成为一片红色（术语称Smear）时，可肯定系统中已经污染了DNA酶。

DNA样品中含有大量RNA时可用RNA酶处理；含有结合在DNA上的杂蛋白与DNA酶时都可用氯仿/异戊醇抽提；当样品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物质时可以通过沉淀更换一个新的缓冲体系。当然，酶切失败时也不能排除除DNA外的一切因素，如无菌水，EP管，吸咀等的干净程度以及内切酶自身的酶活性情况。

除纯度外，DNA的浓度也会影响酶切效果，一般DNA质量浓度在1ug/20ul才能得到较好的酶切效果，质量浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。

        (5)终止酶切反应的方法

如果需对酶切片段进行连接或标记等操作时，首先要将限制酶灭活。灭活的方法可分为三种：第一种是向反应缓冲体系中加入终浓度为10-12.5mmol/L的EDTA，原理是络合掉酶反应中所需的镁离子。但这种方法会影响需镁离子的后续反应。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法来更换缓冲体系，以除去EDTA，但这样就会造成DNA的损失。第二种方法是热失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保温60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保温30min方能达到目的；极端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加热的方法使之失活。热失活方法的特点是简单并且未向体系中引入任何物质，特别适用于连续进行几个酶切反应；热失活法的另一个特点是不用更换体系，所以不会造成DNA的损失。第三种方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。这种方法的特点是处理条件剧烈，能使酶彻底失活（不像第一种方法中酶蛋白并未变性而只是没有激活因子而已）。