实验五    大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

                                 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+  的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

                                本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂

1. 仪器：

        恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

        2. 材料

E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：

LB培养液（1L）：

    胰蛋白胨                                  10g

    酵母粉                                      5g

    NaCl                                         10g（高盐）或5g（低盐）

   氨苄青霉素（Ampicillin）     100mg/ml

在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl  5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中加入1.5ml  100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。

        LB平板培养基：

                          胰蛋白胨            10g

                          酵母粉                 5g

                          NaCl                    10g或5g ，

                          琼脂                    13g

在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温至50℃，取出培养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中，根据需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需30～50ml培养基。培养基完全凝结后，倒置平皿并贮存于4℃备用。

        其它试剂：   0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水

    三、操作步骤

        1. 感受态细菌的制备：

      （1）用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，接种于装有5ml LB液体培养基的试管中中，37℃ 220 rpm振荡培养过夜（12～16h）。

     （2）取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中中，37℃，220 rpm振荡培养2－3h，隔20－30min测量OD600值，至OD600值为0.3-0.4。无菌条件下将细菌转至1.5ml 离心管中，每管1ml菌液，按需要决定管数。

     （3） 4℃，12000 rpm，离心2 min，以回收细菌。

     （4）倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量培养液流尽。每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min 。       

       （5）4℃，12000 rpm，2 min。

      （6）倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮细胞（重悬时操作要轻），即成感受态细胞悬浮液。

        2.细菌转化：

     （1）取3只灭菌的Ep管，分别编号1、2、3、分别加入以下各组分：加入10～20ng质粒DNA（体积小于10ul），同时做两个对照组：

      1号：受体菌对照组：  100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O

      2号：质粒DNA对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

      3号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19

    （2）轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，促进DNA分子在感受态细胞表面的吸附。

           （3）转入42℃水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用，使细胞膜产生通道，便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。

    （4）迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。

            （5）加600u无抗生素lLB液体培养基，摇匀后于37℃，220 rpm，振荡60min。使受体菌恢复正常生长状态，并且表达Ampicillin抗性基因。

    （6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至液体被吸收，37℃恒温培养箱倒置培养12－16h后观察结果，其余保存于4℃。如果平板上没有长出菌落，可将之置于37℃恒温培养箱继续培养，同时将剩下的500ul菌液离心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重悬，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃培养。

     （7）观察并记录转化子出现的数目，计算转化率。

    四、注意事项：

        1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。

        2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。

        3. 必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。

        4. 整个实验过程均需置于冰上。

       5. 选用对数生长期细胞，OD600不应高于0.6。

实验六  动物组织细胞基因组 DNA提取

  一、实验原理

        真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

    二、仪器及试剂

       1. 仪器：

       恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）

       2. 试剂：

（1）细胞裂解缓冲液：

Tris (pH8.0)                         100 mmol/L

EDTA (pH 8.0)                   500 mmol/L

NaCL                                  20 mmol/L

SDS                                    10%

胰RNA酶                         20ug/ml

（2） 蛋白酶K：  称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。

（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、

（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE  重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

四、常见问题

1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。

2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。

3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。

6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。

实验七    DNA的定量

一、  实验原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。DNA 本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）插入DNA 的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1～5ng。由于是基于目测，所以是估计水平。 该方法经济简便，但准确性较低。

二、仪器及试剂

        1. 仪器：Amersham   GeneQantTM Pro 紫外可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳设备。

2. 试剂及配制：

5×上样缓冲液：

配制10 ml

          0.5 mol/L EDTA(pH8.0)        2 ml

              10%  SDS                            50 ul

              50% 甘油                           2.5 ml

             0.2% 溴酚蓝                     10 mg

             0.2% 二甲苯青FF          10 mg

              加去离子水至10 ml  

其它试剂：0.1×TE 、DNA标准液，EB储存液（10 mg/ml），

三、实验步骤

 1.紫外分光光度法

   （1）用0.1×TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。

   （2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument  Ready”时，进入核酸测定窗口

   （3）调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set  ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

  （4）吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5～7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。

 （5）打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。

      （6）DNA纯度：以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值 <1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿―异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA。

2. EB荧光分析法

      （1）琼脂糖凝胶的制备。

      （2）样品的准备。把待测DNA样品进行1:2连续稀释，并准备一份DNA标准液作对照。

      （3）上样。稀释样品与上样缓冲液按1:5混合均匀后上样。

      （4）电泳。用100V稳压电泳至溴酚蓝指示剂迁移到凝胶的3/4处停止电泳。

       （5）取出凝胶，入EB荧光染液中作用20min，取出后清水漂洗干净，然后紫外检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸样品中的严重污染干扰核酸紫外线吸收物质的情况。

四、常见问题

1． 紫外分光光度法不能区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线状三种构型，也不能区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。

2．OD320值是背景，若溶液盐浓度越高，OD320也越高。

         3．测样品时使用的石英样品杯比较贵，要小心不要摔破，持杯时也不要接触透明的光面以避免干扰测定。

               实验八     PCR基因扩增

      一、实验原理 

       聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

         PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 现用图示说明PCR原理:

二、仪器及试剂

1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等

    2.试剂：

    10X PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：

                 250～500 mmol/L     KCl

                 100～500 mmol/L     Tris-Cl（pH8.4）

                 15～20 mmol/L        MgCl2

                 0.5%                         Tween-20

                  1mg/L                      BSA

   其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶、等

 三、操作步骤

        1.  PCR 体系（40ul）：

                  4ul    10XPCR 缓冲液

                  4ul    25mM MgCl2（根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定）

                 Xul    模板DNA ≥50ng

                 1ul    上游引物（50-100ng）

                 1ul    下游引物（50-100ng）

                 1ul    dNTP Mixture（终浓度20－200uM）

                 0.4 ul    Taq聚合酶

        加ddH2O至40ul

       视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

        2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。

       3. PCR反应热循环程序设置：

    （1） 95℃   300s       变性

    （2） 94℃   45s         变性

    （3） 55℃    45s        退火（根据不同引物可能有不同退火温度）

    （4） 72℃   45s         延伸（每分钟可延伸1kp）

      重复步骤2-4共 30 循环

   （5） 72℃   600s      延伸

       反应结束后短暂离心，吸取少量（10ul）进行分析，其余置

4℃保存备用。

        4. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

四、 注意事项：

       1. PCR 体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。

2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。

 五 、影响PCR的主要因素

        1.模板DNA

         单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR反应时模板变性要充分。

        2. PCR引物

         PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产物最关键的因素之一。在设计和应用时，需注意以下重要环节：

      （1）PCR引物的长度约为18～30个核苷酸，并且成对引物间的G＋C含量应相似。以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C含量应为45%～55%之间。碱基分布是随机的，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3，端出现3个连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避免选用T ,尤其应避免连续出现2个以上T。

     （2）一般来说，PCR产物≤500bp时，引物长度选择16-18bp；PCR产物≥5kb时，引物长度选择24bp左右为宜。

     （3）要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个PCR引物相互之间的3，末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。

     （4）引物的熔点温度（Tm值）要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关；PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于55℃为宜。

     （5）引物的3，末端必须与模板严格互补，而5，末端的要求可灵活些。

      （6）目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。

      （7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。

      （8）引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。

         3. 热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

    一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类酶的最适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。

         4. dNTPs

          PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度

低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的dNTP浓度。

         5. PCR缓冲液

         因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+的浓度，所以应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR反应中（dNTP浓度200umol/L），Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。浓度高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。

          6. PCR循环的温度

         预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为94℃ 3-5min。变性不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜超过95℃），会影响Taq酶的活性。

         变性：一般为94℃ 30s或95℃ 20s。

 引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物3，端不正确核苷酸的错误延伸。

         延伸：一般为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在72℃保留5min，以保证PCR产物合成的完整性。

         7． 平台效应和PCR循环的次数

         在PCR基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产物，又不要无意义地增加循环次数。

         8. 操作环境

避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA的污染等。

实验九 琼脂糖凝电泳分离与纯化目的DNA

一、实验原理

                   分离和纯化DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同大小的片段分离位于不同的位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得目的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝固成凝胶。由于双链DNA的解链温度高于65℃，所以可以熔化凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时回收DNA片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、进行限制酶切割和连接反应等。

二、仪器及试剂：

1.仪器

电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心管、吸头等。

 2.试剂：

 低熔点琼脂糖、待纯化的DNA、凝胶回收试剂盒、去离子水或TE（pH7.6）。

三、操作步骤：

1.配制1％的琼脂糖凝胶，在适当的位置切一条与加样槽平行的槽，换低熔点琼脂糖凝胶。

2.加样，100V电泳，观察所需片段是否移至低熔点胶内。

3.在紫外灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5 ml离心管中，于70℃热水中熔化。

4.按凝胶回收试剂盒说明书操作。

12.取适量纯化好的目的DNA在 GeneQuant 中检测，确定纯度和浓度，其余样品于-20℃保存。

        四、 注意事项：

1. 配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲洗干净

实验十  DNA重组

   一、实验原理 

        外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。

        T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。

    二、仪器及试剂：

        1. 仪器：

        台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。

        2. 试剂：

T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、 载体DNA、外源DNA。

    三、操作步骤

       1. 外源DNA片段和载体DNA的连接

       取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer                       2.5 ul

酶切后的DNA片段  *1                           约0.3 pmol

酶切后的载体DNA  *2                             约0.03pmol

T4 DNA Ligase                         1ul

ddH2O                             加至 25ul

*1  DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。

*2 相同末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液。

3.将反应管放入16℃过夜反应（12～16h）。

4.取出约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒DNA片段和酶切DNA片段作电泳。

5.用0.1×TE将连接混合物稀释至50ul，使用10～20ul转化大肠杆菌感受态细胞。

四、注意事项

1. 连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。

2. 根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用量也增大。

3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。

4. 防止载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处理线性载体，去掉载体的5¹?C磷酸以抑制DNA片段的自身环化。

5. 正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。

五、相关问题

1. 连接反应的影响因素

 除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响连接反应的因素还有很多，如缓冲液组分、连接温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片段末端的碱基序列等。

（1）连接缓冲液的影响

不同的公司提供的连接缓冲液可能有所不同，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。

（2）pH的影响

一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。

（3）ATP浓度的影响

         连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。

（4）连接温度与时间的影响

因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。

（5）酶浓度的影响

根据New England Biolabs公司对T4 DNA连接酶的定义，1U的酶可在16℃ 30min内连接20ul体系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端为0.12umol/L 5,末端，此时DNA质量浓度约为300ng/ul）的50%。日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶（几百个单位/ul），所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。

（6）DNA浓度的影响

尽管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但考虑到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效连接产物，所以DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。相比较而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的连接产物，所以，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。此外，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。

2. 三种连接酶单位定义

（1）Weiss单位

连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位。他的单位定义为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。现在大多数厂商仍使用这种单位。

（2）d（A-T）环化单位

由于Weiss单位定义中测试的是T4 DNA连接酶中除连接功能外的另一种磷交换功能，并且测试温度高达30℃，与实际连接反应相比无论在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正度量连接功能的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测。d（A-T）环化单位的定义为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d（A-T）（约2kb长）转化成抗外切酶的形式。

（3）黏性末端单位

与Weiss单位相比，d（A-T）环化单位更接近实际，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片段，与实际连接中4种碱基随机排列不符；再说，如果连接酶将片段连接成多聚体而末环化时，仍可能被外切酶组所切；除此之外，与实际上大多数连接反应使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高。为了衡量实际连接条件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最实用的黏性末端单位，它的单位定义为：16℃ 30min内将5,末端浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%连接上。

实验十一 动物组织细胞总RNA的提取

一、实验原理

     RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。

        本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳 进行鉴定。

二、仪器和试剂

1.仪器：

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

2.试剂：

(1)细胞裂解液：

         异硫氰酸胍                4mol/L

         柠檬酸钠（pH7.0）        25mmol/L

         十二烷基肌氨酸钠            0.5%

          β-巯基乙醇             0.1mol/L

  称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。 

(2)10×凝胶缓冲液：

       吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）   200mmol/L

          NaAc                         100mmol/L

          EDTA(pH 8.0)                 10mmol/L

     过滤除菌后避光保存。

    （3）5×变性上样缓冲液：

           水饱和的溴酚蓝              16μl

           500mmol/LEDTA(pH 8.0)       80μl

            甲醛（37%）               720μl

              甘油                       2ml

         甲酰胺                  3084μl

       10×凝胶缓冲液                4ml

 加无RNase水至10ml，4℃可保存3个月。

（4）TRIzol RNA抽提试剂 

    （5）2mol醋酸钠

    （6）0.1% DEPC

     (7)平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

    （8）平衡酚、氯仿

    （9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇

     (10)无RNase水

三、操作步骤

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

 1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4.将混合物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min.

5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.

6. 4℃，离心12 000r/min，15min.

7. 弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。

8. 弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），?C70℃保存。

（二）TRIzol试剂提取RNA

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。

2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。

3. 4℃，10 000r/min离心15min，RNA分布于水相中。

4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min。

5.4℃，10 000r/min离心10min。

6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。

7.弃上清液，室温干燥15min.

8.向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20℃保存备用。

（三）RNA检测

1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。

  方法同实验四，用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

     （1）制备凝胶（1.2%）。称1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处理水，加热熔化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛（37%）18ml，混匀后，倒胶。

      （2）制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1混匀。65℃温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。

      （3）上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5～2h.。

      （4）待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3～4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色约30min。

       （5）在凝胶成像系统观察并分析。

    四、注意事项

    1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。

    2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70℃ 1 小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。

    3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。

    4.根据RNA样品的紫外吸收OD值，可计算出RNAd 浓度。

       单链RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数

纯RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,说明有蛋白质等污染，应用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。

         5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S 后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化。

主要参考书：

1..金冬雁等译.分子克隆实验指南.  第二版.北京：科学出版社，1995

2.子颖等译.精编分子生物学实验指南. 科学出版，

3.周俊宜编.分子生物学基本技能和策略.   科学出版社

4.姜泊等编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.

5.刘进元等编.分子生物学实验指导.北京：清华大学出版社，2002.