分子生物学实验指导2-厦门国仪科学仪器有限公司

分子生物学实验指导2

分类：基础知识及应用发布时间：2022-07-25 15:52:19 作者: 来源:

实验五 聚合酶链式反应（PCR）

一、实验原理

聚合酶链式反应（PoLymerase chain reaction, PCR）是一项体外特异扩增特定DNA片段的核酸合成技术，这项技术是分子生物学研究领域的一次创举。

PCR通常需要两个位于待扩增片段两侧的寡聚核苷酸引物，这些引物分别与待扩增片段的两条链互补并定向，使两引物之间的区域得以通过聚合酶而扩增。反应过程为首先必须使得待扩增DNA（称为模板）置于高温下解链成单链模板，这一过程叫变性；第二步为分别与待扩增的DNA片段两条链的3’端互补的人工合成的寡聚核苷酸引物（Primer 15-20bp）在低温条件下分别与模板两条链两侧互补结合，这一过程叫退火，第三步是DNA聚合酶在适当温度下将脱氧核苷酸（dNTP：dATP, dCTP, dTTP dGTP）沿引物5’—3’方向延伸合成新股DNA，这一过程叫延伸。变性—退火—延伸，如此循环往复，每一循环产生的新股DNA均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式即2ⁿ扩增的，经过30-35个循环，目的片段可以扩增到一百万倍，在一般PCR仪上，完成这样的反应需几个小时。

PCR原理示意图

二、实验方法

1．在冰上，建立如下PCR反应体系，在PCR管内分别加入：

10×PCR缓冲液 2μL

25mM dNTPS 1.6μL

2．5mM MgCl₂ 1.2μL

Primer 1（10μM） 0.8μL

Primer 2（10μM） 0.8μL

模板DNA（1μg/μL） 1μL

Taq酶（5Μ/μL） 0.2μL

dd H₂O 12.4μL

总体积 20μL

2．将PCR管放入PCR仪中，按如下程序操作。

①94℃预变性2min (开始时模板DNA变性要适当延长)

②94℃变性1 min → 36℃退火1 min → 72℃延伸2 min,共40个循环

③72℃延伸7 min（最后一次延伸的时间也要适当延长）

④4℃贮存。

3．取1—5μL反应产物进行当琼脂糖凝胶电泳检测。

三、PCR优化

要得到预期的PCR扩增效果，从中选定最为适用、重复性最好的条件，要试用不同的反应组分和循环参数，其中Mg²⁺浓度、dNTP浓度、模板DNA含量和Taq酶含量等因素对实验结果都有很大影响，在预备实验中，应分别进行梯度实验和交互组合实验，最终确定优化的PCR反应体系。

四、所需仪器、耗材

1．微量移液枪

2．微量移液枪头

3．PCR管

4．PCR仪

5．离心机

6．离心管

7．玻璃器皿

五、所需试剂

1．随机引物（Primer）（10μM）

2. dNTP (25mM)

3. 模板DNA（1μg/μL）

4．Taq DNA聚合酶（5Μ/μL）

5. 10×PCR缓冲液

6．TBE

7．加样缓冲液

8．MgCl₂（25mM）

六、试剂配制

1．琼脂糖凝胶电泳所需试剂同实验四一样。

2．引物的配制：

订购的引物大多为干粉，附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解、调整浓度后，盖上管盖，充分上下振荡5—10分钟，不用时在-20℃以下保存。

在干粉管上一般都标有260nm下的吸光值，并标出碱基对数，例如一个管标为5 OD的20 mer oLigo DNA意思为一个20bp, 260nm下吸光值为5 OD的寡聚DNA。

分子量（MV）=（A碱基数×312）+（C碱基数×288）+（G碱基数×328）+（T碱基数×303）-61

分子量也可以用以下近似方法计算：

一个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一个引物的分子量=碱基数×324.5

例如：现有一个引物管标为0.2 OD 10 mer如配制引物浓度为10μM,方法如下：

分子量=10×324.5=3245

质量数=0.2×33=6.6μg (1 OD ssDNA=33μg)

摩尔数=6.6μg/3245=0.002 μmoL=2 nmoL

（2 nmoL/10μM）×1000=200μL

所以应加200μL水，此管引物才能调整为10μM。

七、思考题

1． PCR的反应原理是什么？

2． PCR反应体系包括那些成分？

实验六 随机扩增多态性DNA反应（RAPD）

一、相关知识

遗传标记（genetic markers）是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段。其方法主要有4种类型，即形态标记（morphological markers）、细胞学标记（cytological markers）、生化标记（biochemecal markers）和分子标记（molecular markers）。与前三种标记相比，分子标记具有以下优越性：（1）直接以核酸作为研究对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，不受季节、环境限制，与发育时期无关，可用于植物基因型的早期选择。（2）标记数量极多，遍及整个基因组。（3）多态性高，由于自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料。（4）由许多分子标记表现为共显性（codominance），能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，可提供完整的遗传信息。

目前，常用的分子标记技术主要有限制性长度片段多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）、染色体或基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）、mRNA差别显示（mRNA differential display，mRNA-DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、消减杂交法（subtractive hybridization，SH）、代表性差异分析法（representation difference analysis，RDA）、任意引物PCR（arbitrary-primer PCR，AP-PCR）、DNA扩增指纹（DNA amplified fingerprinting，DAF）、单引物扩增反应（single primer amplification reaction，SPAR）、顺序表达位点扩增（sequenced characteried amplified region，SCAR）、加锚微卫星寡核苷酸（anchored microsatellite oligonucleotide，AMO）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、序列标签位点（sequence-tagged site，STS）等等。

一、实验原理

RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为十聚体）为引物，模板在92-94℃变性解链后，如果双链DNA分子在一定长度内具有反向平行又与引物互补的片段，引物的位置是在彼此可扩增的距离内（引物间距为200-2000bp），那么不连续的分子量为200-2000bp的DNA片段就会通过PCR产生。高温变性、低温退火、适度延伸，如此往复循环，经过30～40个循环，产物即可扩增到百万倍以上，如此高产的DNA片段经电泳分离和EB染色后，直接在紫外观察和照相。

RAPD技术简单、容易掌握，在短期内可获得大量的遗传标记，这些优点逐渐被人们接受后，发展神速，短短三年中在生物学的诸多领域，如遗传指纹作图、检测遗传多样性与稳定性（品种鉴定、物种起源与进化）等。

三、实验方法

（一）DNA的提取

同前CTAB法。

（二）纯度检测及浓度调整

同实验四。

（三）操作程序

1．反应体系的制备

冰上建立如下反应体系，夹取一支PCR管，分别加入下列成分：

10×PCR Buffer 2.0 µl

模板DNA（500ng/µl） 1.0 µl

dNTPs（2.5mM） 1.6 µl

MgCl₂（25mM） 2.0 µl

Primer（20µM） 1.2 µl

Taq酶（2.5U/µl） 0.5 µl

加ddH₂O至总体积 20.0 µl

上下吸打混匀，离心收集。矿物油封盖。

2．扩增程序

然后将PCR管放入PCR仪中，按如下程序操作。

94℃，预变性5min；94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

3．琼脂糖凝胶电泳检测

方法同实验三，胶浓度为2%。

四、反应的影响因素及注意事项

（一）影响因素

在RAPD反应过程中，涉及的反应因子很多，且对反应条件敏感，任何一个反应因子设置不当，都会影响整个反应的过程，或者改变带型。通常情况下，实验室要系统地探索各反应条件及影响因子，优化反应体系，得到一个实验条件标准的RAPD反应。

反应过程中的影响因子主要有Taq酶、Mg²⁺浓度、扩增反应温度和时间、循环周期、引物、dNTPs浓度和DNA浓度及纯度等。因而在实验前要对反应体系及扩增条件进行充分的优化。

（二）注意事项

1．冰上配制PCR反应液，然后置于PCR仪上进行反应。

2．DNA质量要求高，应纯化并特别注意防止氧化。

3．反应灵敏，易产生污染而造成假阳性，因此要有对照反应。

4．注意影响因素，并注意“平台效应”的产生。

5．若产物的特异性较低，则可在反应混合物中加入5%的二甲基亚矾（DMSO）等以提高产物特异性。

6．如若产物在琼脂糖凝胶上分辨率较低，则可用聚丙烯酰胺凝胶或梯度凝胶电泳方法来提高分辨率。

五、所用仪器、耗材

PCR仪；微量移液器；离心机；紫外分析仪；电泳装置；PCR管；无菌Tip头；玻璃器皿等

六、所需试剂

10×PCR Buffer；模板DNA；dNTPs（2.5mM）；MgCl₂（25mM）；随机引物（20µM）；Taq酶（2.5U/µl）；加样缓冲液；琼脂糖等。

七、思考题

1．试述RAPD技术与PCR技术的区别。

2．试述为什么RAPD技术重复性较差？

实验七 甜菜M14品系AFLP分析

一、相关知识

（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切

在基因工程技术中，酶切反应为一个关键性的操作过程，选择合适的限制性内切酶，将载体切成符合要求的片段，以便于外源基因的插入。核酸内切酶就是从DNA链的内部进行切割的酶。核酸内切酶分为两类，一类称为非限制性内切酶，另一类称为限制性内切酶。非限制性内切酶就是指那些不识别特定的DNA序列进行切割的内切酶，如脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ），是从牛的胰腺中提取出来的内切酶，DNase Ⅰ对单、双链DNA都很敏感。它可以在DNA链内的任意位置切断磷酸二酯键，没有特定的识别序列。一般说来，经DNase Ⅰ酶解处理过的DNA体系中最终只会剩下被降解下来的单核苷酸和很短的寡聚核苷酸链。

限制性内切酶则与非限制性内切酶相反。它们都能识别一定的DNA序列，在一定的条件下切断DNA链。限制性内切酶分成三种类型，即类型Ⅰ限制性内切酶识别的DNA序列长约十几个核苷酸，或甲基化，或在离该识别序列一端约1000bp的位置上切割DNA，类型Ⅰ限制性内切酶只特定地识别DNA序列，而切割位点却不特定；类型Ⅲ限制性内切酶与类型Ⅰ限制性内切酶有些不同，它也可识别特定的DNA序列，但它切割DNA的位点，往往在识别结合位点很相邻的位置上而不是1000bp那么远；尽管如此，它的切割位点仍就不特异。因而Ⅰ型限制性内切酶与 Ⅲ 型限制性内切酶在基因操作技术中的应用前景并不广泛。类型Ⅱ限制性内切酶不但能特异识别DNA序列，而且识别的DNA序列与酶切割DNA的位置是一致的，它避免了酶切末端的不确定性和可重复性，因而在基因重组技术中有广泛使用。大多数的限制性内切酶并不是在DNA两条链的同一个位置切断的，而是两条链错开两至四个核苷酸断裂，这样产生的DNA末端会带有5′突出或是3′突出的DNA单链，这种末端称为粘性末端。

酶切通常根据操作目的的不同而选择不同的酶切方式，如单酶切、双酶切、部分酶切等等。单酶切是DNA片段化最常用的方法，用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品。而双酶切的两种限制性核酸内切酶可以先后分别在不同的反应系统中切割DNA样品。采用这种方法，应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。

（二）粘性末端的连接

在细胞中，行使连接功能的是连接酶（ligase），这是一类很特殊的酶，它催化DNA或RNA相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口封合起来。常用的连接酶主要有DNA连接酶和RNA连接酶，其主要作用为间断修复功能和连接功能。

理论上讲，连接反应的**温度是37℃，因为在37℃时连接酶的活性最高，但在实际实验中，37℃时粘性末端DNA分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们需要找到一个最适温度，它既要利于最大限度地发挥连接酶的活性，又要有助于短暂配对结构的稳定。目前，常用的连接温度为12-16℃。

由于粘性末端比平末端具有更高的连接效率，因此，在做DNA重组连接实验过程中，人们往往优先选择粘性末端连接。但实际上，并不是所有的连接都已具备了合适的粘性末端，例如大多数情况下一个是粘性末端分子，另一个是平末端DNA，或是两个分子分别具有不同的粘性末端等等。在这些情况下，人们可以采用衔接体（linker）技术、接合体（adaptor）技术和同聚体（homo polymer）加尾技术等。

（三）选择性PCR扩增

原理与标准的PCR完全相同，区别仅在于PCR所用引物不同。标准PCR的引物为已知序列互补的核苷酸顺序，而选择性扩增中，针对中间未知的核苷酸顺序人为的在已知顺序引物的后面随机加上1~3个碱基（要保证一定的GC含量），这样只有与随机的三个碱基互补配对的片段才可能从大量的片段中被扩增出来，因而可根据选择性碱基的数目来控制扩增片段的多少，达到选择性的目的。

引物的组成：（1）核心碱基序列，该序列与人工接头互补；（2）限制性内切酶识别序列；（3）引物3′端选择碱基。

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳

依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA/RNA（5—500bp）****，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，其不足之处为制备和操作较为困难。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。

常用聚丙烯酰胺凝胶有以下两种：

（1）用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶

大多数双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率大略与其大小的1g对数值成反比，但迁移率也受其碱基组成和序列的影响，以致大小完全相同的DNA，其迁移率可相差达10%，这种作用是由于双链DNA在特定序列上形成扭结而造成的。

（2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶

这些凝胶在一种可以抑制核酸中的碱基配对的试剂（如尿素或甲醛）存在下聚合，变性DNA在这些凝胶中的迁移速率几乎与其碱基组成及序列完全无关。放射性DNA探针的分离、S₁核酸酶消化产物的分析及DNA测序反应产物的分析，均采用变性聚丙烯酰胺凝胶。

（五）AFLP技术

1．AFLP技术的优点

理论上由于AFLP采用的限制性内切酶和选择性碱基的种类、数目较多，所以AFLP可产生的的标记数目是无限的；基因型的AFLP分析，每次反应产物经非变性PAGE电泳检测到的谱带数在50～100条之间，所以该技术是DNA多态性检测的一个非常有用的技术；AFLP标记是典型的孟德尔方式遗传；AFLP分析的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，因此AFLP标记可以用于作为遗传图谱和物理图谱的位标；AFLP 既可以用于分析不同复杂程度的基因组DNA，也可用于分析克隆的DNA大片段，因此它不仅是一种DNA指纹技术，也是基因组研究的一个非常有用的工具；DN A的随机扩增，受模板浓度的影响较大，而AFLP的一个重要特点是对模板浓度变化不够敏感。VOs等人在西红柿的 AFLP分析过程中发现模板浓度相差1000倍的范围内，得到的结果基本一致。只是模板浓度很低时，谱带较弱，甚至有缺失；AFLP技术另一个重要特点是，在反应过程中，标记的引物会全部耗尽，当引物耗尽后，扩增带型将不受循环数的影响。由于AFLP对模板浓度不敏感，这样利用过剩的循环数，即使模板浓度存在一些差异，也会得到强度一致的谱带。因此AFLP技术能够检测谱带强度的多态性。

2．AFLP与其它分子标记技术的比较

每一种分子标记都具有其优点和缺点。对于相同的材料，用不同的分于标记揭示的多态性是存在差异的，一般AFLP的多态性比率最大，RFLPRAPD次之。Wang等在对水稻温敏不育等位系的研究中报道，三种分子标的多态性比率依次为AFLP〉RAPD〉RFLP（26.67%；4.00%；1.67%）。同时Lin等在大豆的分析中同样证明AFLP的多态性最高。

特性 RFLP RAPD AFLP

分布普遍普遍普遍

可靠性高中等高

重复性高中等高

遗传性共显性显性显性或共显性

多态性中等高非常高

DNA需求 2－30ng 1-100ng 100ng

放射性一般有无有或无

技术难度中等简单中等

样品生产率中低高非常高

时间因素长快中等

与其它分子标记相比，AFLP的特点主要表现在它结合了RFLP及RAPD各自的优点，方便快速，只需要极少量DNA材料，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，试验结果稳定可靠，可以快速获得大量的信息。而且再现性高，重复性好，因而非常适合于品种指纹图谱的绘制，遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。在一些多态性很少而且待测样品较少的情况下，用AFLP分析能达到满意的结果。对高密度基因图谱的绘制或对某个基因所在区域的精细作图，AFLP是较为理想的方法。AFLP所产生的多态性远远超过了RFLP、RAPD等，目前被认为是DNA指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术。

3．AFLP技术的应用

AFLP技术诞生以来，己广泛地用于生物的基因组分析。如植物的抗性基因定位及染色体作图，病原菌的亲缘关系分析。由于它对基因组的微小变化具有较好的分辨能力，因而它也被广泛地用于同一病原真菌的营养体的亲和群及病菌的无毒基因与病菌的毒性分析。

①AFLP技术用于细菌的分类和鉴定的研究

ALFP的可重复性比RAPD要强，在细菌分类方面的适用范围与RAPD、RFLP和细菌可溶性蛋白质谱相似。但AFLP综合以上各方法的优点，分辨率仅低于全基因组序列分析，稳定性强，可提供更为丰富的分类信息。

②AFLP技术用于真菌分类研究

AFLP是一种强有力地表示真菌分子特征的新技术，其操作过程方便，区分鉴定结果可靠，该技术在病原真菌方面的应用己十分引人注目，己发展出一些实用的程序来区别一些特殊菌株，用于分型、鉴定并研究其亲缘关系。它可以分析其不同种属间的差别，甚至还可以揭示种内不同菌株间的细微差异，从而弥补了表型分型的不足，更为精确地分析致病真菌本质上的差异。该技术被应用于镰刀菌（Fusarmiu graminearum）不同来源分离株的鉴定和区别，得到了良好结果。

二、实验原理

1991年，Gustava等人用非常短的5个碱基、8个碱基及10个碱基的寡核苷酸片段作引物，随机扩增人、动物、植物、真菌、细菌以及病毒DNA获得成功，他们称之为扩增片段长度多态性（Amplification Fragment Length Polymorphisms，AFLP）。1992年由Zabeau 和Vos创立的AFLP技术与前述内容大不相同，该方法结合了RFLP(restriction fragment Length polymorphisms)技术和RAPD技术的特点，使用人工接头（Adaptor）与限制性内切酶酶切的基因组DNA片段连接并以此为DNA模板，合成系列3`—末端随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的PCR引物，来进行PCR特异条件扩增，经电泳检测后可获得DNA指纹图谱。

基因组DNA

CTGCAGNNNN…NNNNCTGCAG…

GACGTCNNNN…NNNNGACGTC

PstⅠ酶切

GNNNN…NNNNCTGCA

ACGTCNNNN…NNNNG

加人工接头

5’---CTCGTAGACTGCGTACATGCA---3’

3’--- CATCTGACGCATGT ---5’

T4连接酶连接

lCTCGTAGACTGCGTACA TGCA GNNNN…NNNNCTGCA

CATCTGACGCATGT ACGT CNNNN…NNNNG

选择引物PCR扩增

CTCGTAGACTGCGTACATGCAGNNNN…NNNNCTGCA

CATCTGACGCATGTACGTCNNNN…NNNNG

Ps1--GACTGCGTACATGCAGACC

Ps2—GACTGCGTACATGCAGCTG

凝胶检测

（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切

限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度、缓冲体系、离子种类与浓度、DNA的纯度、DNA分子的甲基化程度等等。限制性内切酶的反应缓冲液中一般含有MgCl₂，NaCl或KCL，Tirs-HCl，二硫苏糖醇（DTT）或β-疏基乙醇，有的还含有牛血清蛋白（BAS）。Mg²⁺是限制性内切酶的辅助因子，Tris-HCL保持整个反应体系的pH值；不同的酶对于Na⁺或K⁺有不同的要求，DTT和β-疏基乙醇有助于酶在体系中的稳定。

DNA的纯度对于酶切效果影响很大，因为蛋白质、酚、氯仿、SDS等杂质污染DNA以后，能直接抑制酶的活性。在实验时，为了克服这些杂质的影响，采取的措施或者是延长反应时间，或是增加酶量，也可以既增加酶量，又延长反应时间取得好的反应效果。

不同的限制性内切酶，其最适反应温度也可能不同，内切酶标准反应温度为37℃，但也有许多例外，如Sma I 的最适反应温度为25℃，Taq I 的最适反应温度为65℃。内切酶的活性定义：在50 μL反应液中，适宜的温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位。

限制性内切酶的贮存液通常含有50%的甘油，而甘油在反应体系中超过5%时，就会影响酶切的特异性，因此作酶切反应时加入酶的体积不应超过反应总体积的1/10。

酶切的时间因实验而异，是由DNA样品的浓度、纯度及酶的浓度决定的。DNA样品浓度高、纯度差或酶的浓度太低都可以适当延长酶切时间。酶切体系的体积一般以20-50 μL为宜。如果DNA样品是基因组DNA，那么时间可以延长至18个小时或过长。

EcoR Ⅰ：

5′----GAATTC---3′ 5′---G AATTC---3′

3′----CTTAAG---5′ 3′---CTTAA G---5′

Pst Ⅰ:

5′---CTGCAG---3′ 5′---CTGCA G---3′

3′---GACGTC---5′ 3′---G ACGTC---5′

BamH Ⅰ:

5′---GGATCC---3′ 5′---G GATCC---3′

3′---CCTAGG---5′ 3′---CCTAG G---5′

（二）接头的连接

（三）选择性PCR扩增

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶（poLyacryLamide geL, PAG）是由丙烯酰胺（acryLamide）和交联试剂N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis；N，N’—methyLenebisacryLamide）在有引发剂如过硫酸胺和增速剂如N,N,N’,N’—四甲基乙二胺(TEMED)存在的情况下聚合而成的。丙烯酰胺的单体形成长键，由N,N’—甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交朕形成凝胶，凝胶的孔径由链长和交联度所决定。

聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是装于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开,并封以绝缘胶布。在这种配置的形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制局限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10—100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：①分辨力强，长度仅仅相差0.2% (即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开；②所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶，多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽而不致显著影响分辨力；③从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验。

三、实验方法

（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切

1．本试验所用DNA为从甜菜叶中提取的基因组DNA，选用三种限制性内切酶进行单酶切反应，分别为Pst Ⅰ、和BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶。

2．取三个0.5mL离心管，按顺序加入以下成分，反应总体积为 20μL。

灭菌水 16μL

10×限制性内切酶缓冲液 2 μL

基因组DNA（1mg/mL） 2 μL

限制性内切酶 1 μL

3．上下吸打混匀，快速离心收集使溶液全部聚于管底部，将离心管放在水浴中，根据不同酶的**作用温度保温2.5—4 h。

4．置65℃水浴中灭活15分钟，终止酶切反应。

5．取10 μL酶切过的溶液，加入2 μL 6×上样缓冲液在1% 琼脂糖凝胶上电泳，电泳时以分子量Marker为分子量对照，电泳电流为60--100mA。

6．电泳结束后，在紫外灯下进行观察，酶解完全的总DNA在泳道上应呈均匀的弥散状，其中还经常可见亮一些的条带，这些是重复序列。

（二）接头的连接

1．每种限制性内切酶都有各自配对的接头，其序列具体如下：

EcoR Ⅰ：

Ead1： 5′--CTC GTA GAC TGC GTA CC--3′

Ead2： 3′--CAT CTG ACG CAT GGT TAA--5′

Pst Ⅰ：

Pad1： 5′--CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA--3′

Pad2： 3′--CAT CTG ACG CAT GT--5′

BamH Ⅰ：

Bad1： 5′--GGG TCG AAT TCG AGC TCA G--3′

Bad2： 3′--CCC AGC TTA AGC TCG AGT CCT AG--5′

2．接头的制备：

①先将接头中每个单链部分配制成浓度为50μM的溶液，根据摩尔数计算加水量；

②分别从两管中取25μL溶液加入PCR管中，经94℃变性2min，36℃退火5min后，自然冷却至室温，两个互不寡聚核苷酸链便结合成为人工接头，做好标记备用。

3．制备连接反应体系：

取一支PCR管，冰上依次加入下列成分：

酶切模板DNA 250 ng（5 μL）

25μM接头 0.2 μL

T₄ Ligation Buffer 5 μL

T₄ Ligase（3U/μL） 0.6 μL

ddH₂O 39.2 μL

总体积 50 μL

4．吸打混匀，16℃条件O/N，进行连接反应。

5．加0.1×TE Buffer至终体积250 μL，4℃保存备用。

（三）选择性PCR扩增

1．三种限制性内切酶用到的选择扩增引物，其序列具体如下：

EcoR Ⅰ：

Es1： 5′--GAC TGC GTA CCA ATT CGT C--3′

Es2： 3′--GAC TGC GTA CCA ATT CAG C--5′

Pst Ⅰ:

Ps1： 5′--GAC TGC GTA CAT GCA GCT G--3′

Ps2： 3′--GAC TGC GTA CAT GCA GAC C--5′

BamH Ⅰ:

Bs1： 5′--TTC GAG CTC AGG ATC CGT G--3′

Bs2： 3′-- GAG CTC AGG ATC CAC G--5′

2．选择引物的制备：

使用前根据摩尔数将引物配制成终浓度66 ng/μL，备用。

3．制备PCR反应体系：

取一支PCR管，冰上依次加入下列成分：

10×PCR Buffer 2.0 μL

2.5 mM dNTP 1.6 μL

25 mM MgCl₂ 1.2 μL

选择引物 1.0 μL

TaKaRa Ex Taq（5U/μL） 0.2 μL

连接模板DNA 10.0 μL

ddH₂O 4.0 μL

总体积 20 μL

4．吸打混匀，离心收集。

5．PCR仪扩增，循环程序如下：

94℃，5 min

94℃，30 sec

68℃，30 sec（每个循环降低0.7℃） 12 Cycles

72℃，1 min

94℃，30 sec

56℃，30 sec 23 Cycles

72℃，1 min

72℃，5 min

4℃保存，Hold。

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

1．已商品化的电泳装置有多种类型，而玻璃板与间隔片之间的配置也因制造厂商的不同而略有差异，间隔片的厚度介于0.5—2.0mm。凝胶越厚，电泳时产生的热量就越大,过热会导致出现“微笑”DNA条带或其他问题，因此，凝胶薄一点更好。在玻璃板与间隔片之间要形成不透水密封，以免未聚合的凝胶溶液漏出。一般两块玻璃板的大小略有差别。本实验所用的电泳槽为北京六一仪器厂生产的DYY—III 28D型电泳槽。实验前，把玻璃板及橡胶框要彻底清洗，然后分别把两块玻璃板插入橡胶框中，其中小玻璃板插入带有下凹槽的缝中。用琼脂糖（1~1.2%）将大、小玻璃板的底部封住。一个电泳槽有两个这样的橡胶框。

2．将载有玻璃板的两个橡胶框分别放入电泳槽的夹隔中，其中短玻璃一面向内，固定位置，拧紧两侧及底部的螺丝。

3．拿两个50mL小烧杯，按下表分别配制40mL的聚丙烯酰胺凝胶溶液。在配制聚丙烯酰胺凝胶溶液时，可以先把水、40%丙烯酰胺、5×TBE和10%过硫酸胺混合，等到灌胶前再加入TEMED，否则凝胶要很快聚合。

4．将电泳槽斜靠在一白色瓷盘边上，与桌面大约成10—20°角，向混合液中加入TEMED，旋动烧杯以混匀溶液。

试剂	制备不同浓度（%）凝胶所用试剂的毫升数（总体积40mL）
试剂	6%	5.5%	5%	4%
H₂O 25.6mL		26.1mL	26.6mL	27.6mL
40%丙烯酰胺 6mL		5.5mL	5mL	4mL
5×TBE 8mL		8mL	8mL	8mL
10%过硫酸胺 360μL		360μL	360μL	360μL
TEMED 40μL		40μL	40μL	40μL

5．将烧杯中的溶液沿下方的橡胶框中的长玻璃液一侧倒入两块玻璃板的空隙处，注满至顶部，如有气泡，用一细棒将其排出。

6．立即插入适当的梳子，梳子平的一侧要靠近长玻璃板。

7．将电泳槽反转过来，使另一个没有灌胶的橡胶框处在下方，用同样方法灌胶。

8．将电泳槽放正，在室温下聚合60分钟。如果凝胶明显收缩，应补加丙烯酰胺溶液。聚合完全后，在梳子下方可以看见折射率不同的纹线。

9．如果不接通冷却水循环装置，应用夹子夹紧连接贮液槽的两根橡胶管。

10．凝胶聚合完毕后，小心取出梳子，立即用水冲洗加样孔，用1×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽。

11．接上电极，上贮液槽导线与电泳仪的负极相连（黑对黑），下贮液槽导线与电泳仪的正极相连（红对红），设定电压及电流，按下电泳仪的工作开关，进行预电泳20—30分钟以除去加样孔处的杂质。

12．将工作开关放到预置挡的位置，将DNA样品与适量的凝胶加样缓冲液混合，用移液枪吸取混合液，将Tip头靠近加样孔对应的长玻璃板注入样品。

13．设定好电压及电流(一般设置恒流30 mA，亦可在200V)，按下电泳仪的工作开关，进行电泳（大约3—4个小时）。

14．电泳至标准参照前沿指示剂位置时，切断电源，拨出导线，弃去缓中液槽内的电泳缓冲液，拧开固定螺丝，卸下玻璃板和橡胶框，用薄钢勺将上面的玻璃板从一角撬起，用洗瓶冲洗凝胶，使凝胶完全附在一个玻璃板上，再用洗瓶冲洗凝胶与玻璃板的空隙，使凝胶彻底与玻璃板分离，用水的力量把凝胶冲入白瓷盘中，（在此过程中，切勿用手及其它工具接触凝胶）。

15．用去离子水清洗凝胶3次，然后放入固定液中（固定液的体积以没过胶面0.5cm为宜）固定10分钟。

16．倒掉固定液，用去离子水清洗凝胶3次，然后放入染色液染色10分钟。

17．倒掉染色液，用去离子水清洗凝胶3次，然后放入显影液中显影10—20分钟。

18．等到DNA条带清晰显现出来时，凝胶再用清水冲洗一遍，然后用10%甘油浸泡过的玻璃纸包好（不要有气泡），用夹子固定在玻璃板上，在室温下自然封干一夜，封干后取下干胶，进行区带分析。

19．观察记录，结果分析。

四、实验要点

1．酶切时一般的加样次序为水、buffer、DNA，最后加酶液。

2．酶切反应为微量操作，Tip要从溶液表面吸取，以防止Tip沾去过多液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回－20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。

3．由于温差原因，往往在酶切反应的离心管盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样要离心2秒，以集中溶液,否则会发现酶切后体积减小。

4．若电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮得多，表明酶切不完全，这可能是因为以下几个原因：

①反应时间不够长（若反应过夜则可排除此项）。

②酶量不够或酶部分失活，当一管酶加到最后时常会碰到后一种情况。

③如果DNA样品溶于TE缓冲液中且在酶解反应中所占的体积较大时，TE缓冲液中的EDTA可能抑制酶解反应，这时可用乙醇重新沉淀DNA，其步骤为加入1/10体积的3M NaAC，再加入2.5倍体积的无水乙醇，离心（14000g×15min），去上清，再加入75%乙醇（50 μL）洗DNA沉淀，再离心（14000g×15min），去上清，干燥后重新溶于少量TE缓冲液或SWD中。

5．若泳道中的DNA系带混杂，可能是由于DNA样品在初始缓冲液中只是部分溶解或者是因为乙醇沉淀后DNA样品中仍残存有乙醇。

6．电泳条带下部较其他部位亮得多，这可能是因为样品中混有RNA或DNA样品发生了降解。

五、所需仪器、耗材

1．30℃、37℃、65℃水浴 2．电泳仪

3．水平电泳槽 4．垂直板电泳槽

5．移液枪 6．冻冷离心机

7．紫外观测仪 8．高压灭菌锅

9．紫外凝胶成像系统 10．磁力搅拌器

11．酸度计 12．岛津紫外分光光度计

13．超低温冰箱 14．纯水仪

15．低温循环水浴锅 16．超速离心机

17．冰箱 18．鼓风干燥箱

19．冷冻干燥离心机 20．PCR仪

21．离心管 22．各种细口瓶及烧杯

23．夹子 24．玻璃纸

25．洗瓶 26．单面刀片

27．Tip头 28．PCR管

六、所需试剂

1．基因组DNA（1mg/mL） 2．分子量Marker

3．1×TBE配制的1%琼脂糖 4．溴化乙锭贮液（10mg/mL）

5．灭菌蒸馏水（SDW） 6．限制性内切酶及酶切反应缓冲液

7．3M NaAC 8．乙醇

9．上样缓冲液 10、Tris-HCl

11．硼酸 12．EDTA（乙二胺四乙酸）

13．过硫酸铵 14．TEMED（N-N-N’-N’-四甲基乙二胺）

15．冰醋酸 16．硝酸银

17．氢氧化钠 18．甲醛

19．丙烯酰胺 20．甲叉双丙烯酰胺（Bis）

七、试剂配制

1．5×TBE

终体积1L 终体积500mL

Tris-HCl 54g 27g

硼酸 27.5g 13.75g

0.5moL/L EDTA

(pH=8.0) 20mL 10mL

2．0.5moL/L EDTA（pH=8.0）

在800mL水中加入186.1g EDTA-Na₂·2H₂O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

3．10% 过硫酸铵

过硫酸铵1g定容至10mL或者过硫酸铵0.1g定容至1mL。

4．TEMED：商品试剂

5．固定液：10%乙醇，0.5% 冰醋酸

配制：50mL乙醇,2.5mL冰醋酸定容至500mL。

6．染色液： 10%乙醇，0.5%冰醋酸，0.2%硝酸银

配制：50mL乙醇，2.5mL冰醋酸，1g硝酸银定容至500mL，避光保存。

7．显影液：3%氢氧化纳，0.5%甲醛

配制：15g氢氧化纳，6.8 mL 37% 甲醛定容至500mL。

8．40%丙烯酰胺（19：1）：

丙烯酰胺38g，甲叉双丙烯酰胺2g加50mL水将溶液加热37℃，定容至100mL.

9．1% 琼脂糖：0.24g琼脂糖加20mL水，在微波炉中加热。

八、思考题

1．影响酶切的因素有哪些？

2．酶切反应不完全的因素有哪些？

3．简单描述粘性末端的三种连接技术

4．与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶主要有哪些优点？

5．在制备聚丙烯酰胺凝胶时，过硫酸胺和N,N,N’,N’—四甲基乙二胺（TEMED)的作用是什么？

6．试比较AFLP技术与RAPD技术。

实验八 生物信息学

一、相关知识

（一）生物信息学的定义

生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一，同时也将是21世纪自然科学的核心领域之一。其研究重点主要体现在基因组学(Genomics)和蛋白学(Proteomics)两方面。

广义地说，生物信息学从事对基因组研究相关生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释。这一定义包括了两层含义，一是对海量数据的收集、整理与服务，也就是管好这些数据；另一个是从中发现新的规律，也就是用好这些数据。
　　具体地说，生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，找到基因组序列中代表蛋白质和RNA基因的编码区；同时，阐明基因组中大量存在的非编码区的信息实质，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言规律；在此基础上，归纳、整理与基因组遗传信息释放及其调控相关的转录谱和蛋白质谱的数据，从而认识代谢、发育、分化、进化的规律。
　　生物信息学还利用基因组中编码区的信息进行蛋白质空间结构的模拟和蛋白质功能的预测，并将此类信息与生物体和生命过程的生理生化信息相结合，阐明其分子机理，最终进行蛋白质、核酸的分子设计、药物设计和个体化的医疗保健设计。

（二）研究生物信息学的必要性

首先伴随着基因组研究，相关信息出现了爆炸性增长，迫切需要对海量生物信息进行处理。自1995年科学家破译了全长为180万核苷酸的嗜血流感杆菌基因组以来，到目前已有大约60个微生物和若干真核生物，如：酵母、线虫、果蝇、拟南芥的完整基因组完成测序。至2001年的春天，科学家又公布了人类基因组的绝大部分序列，即：人类基因组的工作草图。这些成就意味着基因组的研究将全面进入信息提取和数据分析的崭新阶段。根据国际数据库的统计，1999年12月DNA碱基数目为30亿，2000年4月DNA碱基数目是60亿，现在这一数目已达140亿，大约每14个月翻一番。同时，电子计算机芯片对于数字处理能力的增长也相当于每18个月翻一番。因此，计算机能够有效地管理和运行海量数据。
　　但是，更为本质的原因是基因组数据的复杂性。所谓某种生物的基因组就是指该生物所有遗传物质的总和。生物的遗传物质是一类称为脱氧核糖核酸（DNA）的生物大分子，它是由4种核苷酸串接起来组成的，通常用字符A、T、G、C代表。通俗地说，生物的遗传密码就是这4个字符连接起来的线状长链。这种链往往很长，比如：人的遗传密码就含有32亿个字符，将它们堆起来就构成了一部100多万页、每页有3000字符的“天书”。这本“天书”包含了人体的结构和功能以及生命活动过程的大量信息，却仅仅由4个字符组成，既无词法，又无句法，还没有标点符号，看起来每一页都是相似的。如何读懂它是个极大的难题。基因组研究最终是要把生物学问题转化成对数字符号的处理问题。要解决这样的问题就必须发展新的分析理论、方法、技术、工具，就必须依赖计算机的信息处理。

（三） 当前主要研究内容

1．获取人和各种生物的完整基因组；
2．发现新基因和新的单核苷酸多态性；
3．基因组中非编码蛋白质；
4．在基因组水平研究生物进化；

5．完整基因组的比较研究；
6．从功能基因组到系统生物学；
7．蛋白质结构模拟与药物设计；
8．生物信息学的应用与发展研究。

二、实验原理

本实验的主要内容是将甜菜中的序列表达标签EST（Expressed sequence taqs）与已知数据库中的信息进行比对，从而掌握对未知序列进行功能分析的基本方法。

EST是长约150～500bp的基因表达序列片段。EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5′或3′端进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术。

将EST序列与GenBank进行同源性比较，Score值表示相似性程度，Score值越高，相似性（similarity）越大；E Value值表示随机匹配的可能性，E值越大，随机匹配的可能性越大；Identity值表示与数据库序列一致性的百分比；Positives 表示两条序列氨基酸性质相似比例；Gaps比对时插入空位的比例；Query为检测序列；Subject为数据库中的序列。当Score≤80时，表示未知的EST是新的；当Score值很高时，表示未知的EST与相应的已知基因有高度的同源性，由此可推测此EST与已知基因具有相似的功能。

EST序列分析在EST研究中,使用最多的方法就是序列相似性比较，以此来确定EST的功能。BLAST(Basic Local Alignment Search ToolA)是应用较广的工具软件之一，为同源分析的软件包，包括有BLASTN、BLASTP、TBLASTN、TBLATX、BLASTX等5个软件。BLASTN是将核酸序列与核酸数据库进行比对，BLASTP是将氨基酸序列与蛋白质数据库进行对比，TBLASTN是将蛋白质序列与核酸数据库所有6种翻译序列的对比，TBLASTX是将核酸序列的6种翻译序列与核酸数据库所有6种翻译序列的对比，BLASTX是将核酸序列的6种翻译序列与蛋白质数据库的对比。